Метод заготовки лейкофильтрованных отмытых эритроцитов

В.Н. Мельникова, Е.А. Селиванов, Г.Ю. Кирьянова, Т.А. Ефимова

Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, г. Санкт-Петербург

Трансфузиология №3, 2010

Предложен метод заготовки эритроцитной среды, максимально лишенной примесей лейкоцитов, тромбоцитов и плазмы путем лейкодеплеции с помощью отечественного устройства-лейкофильтр УЛЛ-01 и последующего отмывания изотоническим раствором натрия хлорида, позволяющий повысить ее иммунологическую и инфекционную безопасность. Обоснована возможность хранения этой среды при 4°С в эритроконсерванте SAGM.

Ключевые слова: эритроциты, лейкодеплеция, отмывание, морфофункциональные свойства, безопасность.

Введение

Принцип гемокомпонентной терапии предусматривает использование для коррекции различных патологических состояний гемотрансфузионных сред, максимально очищенных от «балластных» элементов.

Цель трансфузий эритроцитсодержа-щих сред состоит в коррекции анемического синдрома, поэтому аллогенные лейкоциты - носители высокоиммуногенных антигенов (системы HLA и специфичных), не требующиеся для данной категории больных, могут стать причиной возникновения у них посттрансфузионных негемолитических температурных реакций, острой легочной недостаточности, вызвать аллоиммунизацию, рефрактерность к тромбоцитам, иммуносупрессию, а также стать источником лейкоцит-ассоциированных вирусных инфекций.

Кроме того, примесь лейкоцитов служит источником накопления в эритроцитных средах цитокинов и протеолитических ферментов, освобождающихся из быстро разрушающихся белых клеток и обладающих мембранотропным (гемолитическим) действием, что существенно ухудшает условия их хранения. Наличие в эритроцитной среде лейкоцитов и тромбоцитов служит основой формирования микросгустков.

Несмотря на то, что наиболее иммуногенной фракцией крови являются лейкоциты, наличие в эритроцитных средах плазмы также далеко не безразлично для больного. Несовместимость донора и реципиента по белкам плазмы проявляются аллергическими, анафилактоидными и анафилактическими осложнениями. Группу риска в этом отношении составляют пациенты с дефицитом IgA. В связи с вышеуказанным для снижения реактогенности и иммуногенности эритроцитных сред их подвергают дополнительной «очистке» с помощью отмывания или лейкофильтрации в тех случаях, когда они используются в программах трансфузионной терапии у гематологических больных, у пациентов с неблагоприятным трансфузиологическим и/или аллергологическим анамнезом, в детской и акушерской практике.

Однако недостатком взвеси отмытых эритроцитов даже при многократном отмывании является наличие в ней остаточных донорских лейкоцитов (не менее 30%) при отсутствии практически значимой примеси плазмы, а лейкофильтрованных эритроцитов - присутствие плазмы и в значительной мере тромбоцитов. Только сочетание этих двух методов позволяет получить эритроцитную среду, максимально очищенную как от белков плазмы, антител, цитокинов, тромбоцитов, так и от лейкоцитов и их фрагментов.

Целью настоящего исследования являлась разработка метода получения и изучение возможности консервирования эритроцитной среды, максимально обедненной другими компонентами крови. Учитывая результаты наших предшествующих исследований по созданию лейкофильтра и по отмыванию эритроцитов от плазмы, а также литературные данные, представлялось обоснованным на первом этапе заготовки новой среды проводить удаление лейкоцитов из эритроцитной массы (ЭМ), а на втором - отмывание красных клеток. При такой последовательности процедур создаются более благоприятные условия для задержки лейкоцитов при фильтровании (в присутствии плазмы) и возникает возможность исключить из технологии отмывания удаление лейкотромбослоя с подлежащим слоем эритроцитов, что уменьшает потерю красных клеток

Материалы и методы

Для фильтрования ЭМ использовали первое отечественное «Устройство-лейкофильтр для удаления лейкоцитов из консервированной крови и эритроцитных сред УЛЛ-01» производства ЗАО «НПП «Интероко» (ТУ 94444-031-17121966-99). Для заготовки лейкофильтрованных отмытых эритроцитов применение данного устройства является более целесообразным, чем использование нового отечественного лейкофильтра «Лейкосеп».

В соответствии с «Руководством по эксплуатации устройства» в контейнер с ЭМ, полученной из консервированной донорской крови 1-2 суток хранения (снятия лейкотромбослоя не требуется), вводили 50-100 мл изотонического раствора натрия хлорида и тщательно перемешивали с эритроцитной средой. Через фильтровальный узел пропускали промывную жидкость (изотонический раствор натрия хлорида) из соответствующей емкости в объеме около 150 мл, стараясь полностью вытеснить из корпуса фильтра воздух и промывая его. Затем корпус фильтра заполняли эритроцитной средой, вытесняя из него промывной раствор в стерильную емкость, которую затем удаляли.

Лейкофильтрацию выполняли со скоростью 44,7±7,67 мл/мин. Процедуру фильтрования заканчивали вытеснением остатков фильтруемой среды из корпуса лейкофильтра и фильтровального материала (пропуская 50 мл изотонического раствора натрия хлорида) в контейнер с профильтрованной средой. Затем последний герметизировали и отсоединяли.

Для отмывания лейкофильтрованных эритроцитов использовали специальный полимерный контейнер - «Контейнер для отмывания эритроцитов методом центрифугирования» (ТУ 64-2-419-90, АО медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган). Контейнер имеет емкость 500 мл, снабжен тремя полимерными трубками с иглами, предназначенными для присоединения к контейнеру с эритроцитной средой, подлежащей отмыванию, емкостям с отмывающим 0,9% раствором натрия хлорида и емкостям для слива надосадочной жидкости после каждого центрифугирования. Отмывание с центрифугированием в течение 20 минут при 2000 об/мин (1250 g) с охлаждением осуществляли двукратно. Надосадочную жидкость удаляли. Фильтрацию и отмывание эритроцитов производили в стерильных условиях в боксированном помещении. Контроль на бактериологическую контаминацию взвесей стабильно являлся отрицательным.

Для оценки эффективности описанной выше технологии нами изучены cодержание лейкоцитов в исходной ЭМ (в камере Горяева), остаточных лейкоцитов (в камере Nageotte) и остаточного белка плазмы в полученной эритровзвеси (c использованием реактива Ларионовой), а также потери эритроцитов в процессе лейкофильтрации и отмывания. Контролем служили отмытые эритроциты без предварительной лейкофильтрации.

Учитывая высокую актуальность наличия запасов максимально «чистой» эритроцитной среды для службы крови, в предыдущие годы нами разработан специальный эритроконсервант Модежель-глюфосфат, который позволяет хранить лейкофильтрованные отмытые эритроциты в течение 3-х недель. Однако производство препарата Модежель в период перестройки было прекращено и организация выпуска эритроконсерванта Модежель-глюфосфат в настоящее время невозможна по объективным причинам. В связи с этим нами изучена принципиальная возможность хранения при 4°С лейкофильтрованных отмытых красных клеток с использованием современного консерванта для нативных эритроцитов SAGM (10 серий экспериментов). В день заготовки эритроцитной среды и затем еженедельно определяли морфофункциональную полноценность взвесей эритроцитов, исследуя морфологию клеток в плазме (с расчетом морфологического индекса), содержание свободного гемоглобина, процент гемолиза клеток, содержание в них АТФ. Морфологический индекс рассчитывали как сумму произведений процентного содержания отдельных форм эритроцитов и соответствующих коэффициентов (оценивалось 100-200 клеток). Для дискоцитов использовался коэффициент 1,0; для тутовых форм - 0,6 и для сфероцитов - 0,0 (модификация метода Usry R.T.). Кроме того, исследовали процент осмотически неустойчивых клеток и деформируемость эритроцитов (фильтрационным методом при постоянном давлении).Содержание миелопероксидазы (МПО) и лактоферрина (ЛФ) в надстое взвесей отмытых эритроцитов определяли методом ИФА в ИЭМ АМН РФ (профессор В.Н. Кокряков).

Результаты и обсуждение

Предварительное добавление изотонического раствора натрия хлорида в ЭМ, его использование для промывания фильтровального материала и для вытеснения из лейкофильтра остатков среды после фильтрования, несомненно, способствуют эффективности дальнейшего отмывания профильтрованной среды от белков плазмы. Промывание устройства изотоническим раствором натрия хлорида до и после пропускания через него ЭМ не только не усложняет заготовку предлагаемой среды, но и обеспечивает уменьшение ее потерь (за счет вымывания эритроцитов из корпуса фильтра и соединительных трубок).

Результаты исследования содержания остаточных лейкоцитов и белков плазмы в опытной и контрольной сериях представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание лейкоцитов и белков плазмы во взвесях эритроцитов

в опытной (профильтрованные отмытые) и контрольной (отмытые)

сериях экспериментов в день заготовки

Как видно из данных табл. 1, предложенная технология позволяет снизить содержание лейкоцитов на 99,96±0,005% по сравнению с исходной эритромассой. Остаточное количество белых клеток в дозе взвеси профильтрованных отмытых эритроцитов непосредственно после ее заготовки равнялось в среднем 0,55±0,065×106, что соответствует требованиям международных стандартов и обеспечивает надежную профилактику не только иммунологических негемолитических фебрильных реакций, но и аллоиммунизации, а также переноса инфекций, вызванных цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр, снижает риск передачи вируса Т-клеточного лейкоза. В контрольных сериях в дозе взвеси содержание лейкоцитов оказалось на 3 порядка большим - в среднем 0,86±0,170×109.

Двукратное отмывание эритроцитов резко снизило содержание донорского белка в дозе взвесей как в опыте (0,06±0,035 г), так и в контроле (0,05±0,028 г), что на порядок меньше допустимой международными стандартами величины (0,5 г/доза). Поэтому профильтрованные и отмытые эритроциты можно переливать аллергизированным к белкам плазмы больным, IgA-дефицитным пациентам, а также страдающим комплементзависимыми анемиями.

Потери эритроцитов при использовании предложенного нами метода составили сравнительно небольшую величину. Они равнялись в опыте (при определении по снижению содержания гемоглобина) - 12,4±0,20%; в контроле этот показатель оказался несколько меньшим (т. к. отсутствовали потери в фильтрационном узле) - 9,1±0,96%. Однако даже в опытных сериях потери красных клеток приближались к показателю, допустимому при заготовке отмытых эритроцитных сред (10-15%). Такие потери компенсируются преимуществами полученной данным методом эритроцитной среды. Процент гемолиза в результате процедуры изменялся незначительно, содержание осмотически неустойчивых эритроцитов несколько снижалось. Уровень АТФ соответствовал исходному и равнялся 4,59±1,31 мкМоль/ г Hb.

Ранняя лейкодеплеция эритроцитных сред обеспечивает, по нашим данным, отсутствие нарастания при хранении эритровзвеси содержания продуктов распада лейкоцитов, в частности, миелоперок-сидазы и лактоферрина (табл. 2).

В серии профильтрованных отмытых эритроцитов в эритроконсерванте Модежель-глюфосфат исследованные нами ферменты практически отсутствовали в течение всего срока хранения. Лишь в одном из опытов на 21-е сутки было обнаружено крайне низкое содержание миелопероксидазы (23 нг/мл при норме 160±15 нг/мл) и лактоферрина (32 нг/мл при норме 1000±140 нг/мл). В то же время во взвесях отмытых эритроцитов, не подвергшихся лейкофильтрации, имело место нарастание концентрации МПО (с 42,7 нг/мл в первые сутки до 355,5 нг/мл к концу срока хранения) и ЛФ (в среднем, с 580,7 до 4242,5 нг/мл).

Таблица 2

Содержание МПО и ЛФ во взвесях профильтрованных отмытых эритроцитов

(опыт) и отмытых эритроцитов (контроль) в процессе хранения при 4°С

Что касается содержания лактоферрина, то отмечалась значительная вариабельность результатов в разных опытах.

Так, через две недели хранения в контрольной серии опытов его концентрация колебалась от 0 до 5046 нг/мл. Более высокое содержание ферментов в конце срока хранения не профильтрованных взвесей можно объяснить как технологией отмывания в этих сериях опытов (без снятия лейкотромбослоя), что приводит к повышенному содержанию остаточных лейкоцитов во взвеси, так и удалением плазмы, в которой содержатся естественные ингибиторы протеолитических ферментов.

Для изучения возможности консервирования при 4°С лейкофильтрованных отмытых эритроцитов в растворе SAGM, предназначенном для нативных эритроцитов, было поставлено 10 серий исследований. Лейкофильтрацию и отмывание красных клеток осуществляли в соответствии с «Временной инструкцией по методу заготовки эритроцитной массы, максимально лишенной примесей лейкоцитов (путем фильтрования) и плазмы (путем отмывания)», одобренной решением Ученого совета РосНИИГТ.

По завершении лейкофильтрации и двукратного отмывания эритроцитов изотоническим раствором натрия хлорида, после удаления надосадочной жидкости, к красным клеткам опытной серии добавляли эритроконсервант SAGM (2:1). Полученные взвеси хранили при 4°С 21 сутки. Показатели, характеризующие морфофункциональные свойства взвесей эритроцитов в эритроконсерванте SAGM в процессе их хранения при 4°С приведены в табл. 3.

Представленные данные свидетельствуют, что к концу наблюдаемого срока хранения эритроцитов (21 день) уровень АТФ остается достаточно высоким - более 80% от исходного - за счет содержания в эритроконсерванте SAGM аденина. Однако в процессе хранения взвесей отмечено существенное (более чем в 5 раз к 21-м суткам) нарастание концентрации свободного гемоглобина и процента гемолиза красных клеток. Это не позволяет рекомендовать хранение взвесей профильтрованных отмытых эритроцитов в течение столь длительного времени, несмотря на то, что уровень гемолиза не достиг предельно допустимого значения (согласно международным стандартам - 0,8%), а ограничить этот срок одной неделей, что уже немаловажно для деятельности учреждений службы крови. Организация в перспективе производства эритроконсерванта Модежель-глюфосфат обеспечит возможность полноценного хранения лейкофильтрованных отмытых эритроцитов в течение 21-х суток..

Таблица 3

Морфофункциональные показатели взвесей профильтрованных

через лейкофильтр УЛЛ-01 «Интероко» и отмытых эритроцитов

в эритроконсерванте SAGM (n=10) в процессе хранения при 4°С

Заключение

Фильтрование эритромассы через отечественное устройство-лейкофильтр УЛЛ- 01 производства ЗАО «НПП «Интероко» с последующим двукратным отмыванием профильтрованных эритроцитов изотоническим раствором натрия хлорида позволяет снизить содержание лейкоцитов до уровня 0,55±0,065×106 и белка до 0,06±0,035 г в дозе. Заготовленную предложенным методом среду следует использовать в течение 24-х часов, как это предусмотрено действующей инструкцией для отмытых эритроцитов. Взвешивание в растворе SAGM позволит продлить срок ее хранения до 1 недели. Принимая во внимание это обстоятельство, представляется целесообразной организация производства полимерных контейнеров с раствором SAGM с учетом обоснованных в них потребностей.

Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов представляется оптимальным средством гемокомпонентной терапии для пациентов, сенсибилизированных не только к белкам плазмы, но и при наличии анти-HLA, специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител; трансфузионнозависимым больным с целью профилактики аллоиммунизации и острого поражения легких; иммуннокомпрометированным лицам для предупреждения переноса ряда вирусных инфекций; в педиатрии, в том числе в случае аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных; больным с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (частые беременности, выкидыши); для профилактики синдромов «массивных гемотрансфузий» и «аллогенной крови»