К вопросу о контроле качества эритроцитсодержащих компонентов крови, обедненных лейкоцитами

А.И. Костин, О.А. Майорова, А.В. Ложкин, М.Е. Почтарь, М.И. Демичева, В.А. Кузмичев,С.А. Луговская, Е.В. Наумова, Д.Г. Кисиличина, Э.В. Андрейцева, В.В. Долгов

ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии, Минздравсоцразвития, г. Москва

ГУ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения, г. Москва3 ГУ: "Станция переливания крови Департамента здравоохранения, г. Москва"

Кафедра клинической лабораторной диагностики РМАПО, г. Москва

Трансфузиология № 2, 2011

Проведено сравнение параметров контроля качества эритроцитной массы, обедненной лейкоцитами, после применения систем для лейкоредукции российского производства: «Лейкосеп» Интероко и ПК 02-01 «Виробан», основным элементом(фильтрующим узлом) которой является встроенный фильтр PALL зарубежного производства. Подсчет количества остаточных лейкоцитов в компонентах крови осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. Использовали набор Kit Flow-Count Fluorospheres и моноклональные антитела против CD45. Применение системы«Виробан» при соблюдении температурного режима (охлаждение перед фильтрацией до +4°С) обеспечило адекватную лейкоредукцию эритроцитной массы, соответствующей стандарту качества ЕС в 90% наблюдений.

Ключевые слова: контроль качества компонентов крови, подсчет остаточных лейкоцитов, эритроцитная масса, лейкоредукция, проточная цитофлюориметрия.

Введение

Развитие высокотехнологичной медицины обусловило повышение требований к качеству компонентов крови. Значительный рост трансфузионной активности в течение последних 10 лет, восновном за счет увеличения трансфузий тромбоцитного концентрата, неизбежно привел к росту посттрансфузионных осложнений и удорожанию лечения. В России не существует достоверного учета нежелательных реакций, связанных с трансфузиями, не проводится многоцентровой фармакоэкономический анализ затрат на трансфузионное пособие и, возможно, в связи с этим не кажется такимактуальным изучение проблем качестваи эффективности переливаний компонентов крови. Несомненно, что детекция патогенов в компонентах крови и профилактика распространения социально-значимых инфекций - краеугольные проблемы трансфузионной медицины, однако качество трансфузионных сред является первостепенным в обеспечении эффективности трансфузий и профилактике подавляющего большинства тяжелых посттрансфузионных реакций. Лейкодеплеция является одним из самых доступных методов повышения качества трансфузионных сред.

Повышение безопасности компонентов крови, обедненных лейкоцитами, основанное на доказательствах

Применение компонентов крови,обедненных лейкоцитами, позволяет снизить частоту трансфузионно-опосредованной иммуномодуляции, аллоиммунизации к HLA антигенам класса 1,развитие фебрильных посттрансфузионных негемолитических реакций, а также уменьшить риск передачи таких клинически значимых инфекционных агентов, как цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр и HTLV. До 2001 г. было проведено11 исследований, посвященных влиянию лейкодеплеции на аллоиммунизацию ирефрактерность к трансфузиям тромбоцитных концентратов. По мнению ряда авторов, лейкодеплеция не предотвращает возникновение выше указанных осложнений. Из других источников следует,что лейкодеплеция позволяет предотвратить аллоиммунизацию и уменьшить долю пациентов с иммунной рефрактерностью к трансфузиям тромбоцитов. Наиболее достоверными являются данные многоцентрового исследования TRAP (The Trial to Reduce Alloimmunizationof Platelets). В связи с чем, общепринятым считается, что лейкоредукция уменьшает аллоиммунизацию и предотвращает возникновение рефрактерности к трансфузиям ТК. Такие же обнадеживающие данные получены при ретроспективном анализе 13 902 трансфузий тромбоцитовв Канаде у 617 пациентов c острым лейкозом, получившим программную химиотерапию с последующей трансплантацией СКК. Сравнивали 315 пациентов до введения универсального удаления лейкоцитов (УУЛ) и 302 после. Доля пациентов саллоиммунизацией снизилась с 19 до 7%, аллоиммунной рефрактерностью с 14 до 4%. У пациентов с острым лейкозом в канадском исследовании после введения УУЛ доля пациентов (не количество реакций от всех трансфузий) с фебрильными негемолитическими реакциями на транфузии тромбоцитов уменьшилась с 14 до 5%. В странах, узаконивших УУЛ, продемонстрировано снижение частоты развития фебрильных негемолитических реакций у пациентов с высокой трансфузионной зависимостью на 50% - после трансфузий эритроцитов и на 75-90% -14 после трансфузий тромбоцитов. Так, за 2007 г. в 88 госпиталях Японии в результате проведения около 1 млн трансфузий клеточных компонентов крови зарегистрировано 638 посттрансфузионных гипертермических негемолитических реакций, что составляет приблизительно 0,06% от всех трансфузий. Еще одна немало важная причина, по которой многие клиники предпочитают использовать лейкоредукцию, - это снижение риска после операционных инфекций и улучшение после операционной выживаемости пациентов в результате редукции механизма, обусловленной трансфузиями иммуномо-дуляции и повышения иммунологической безопасности трансфузий.Многие авторы сходятся во мнении, что применение компонентов крови, обедненных лейкоцитами, у хирургических больных на 50% снижает риск послеоперационных инфекций. По данным Blumberg (2010 г.), при ретроспективном исследовании впервые было показано также снижение частоты развития TRALI синдрома и ассоциированной с трансфузиями циркуляторной перегрузки соответственно на 83 и 49% у пациентов, получавших только лейкофильтрованные компоненты крови. В большинстве предшествующих публи-каций отрицалась возможность какой-либо профилактики этих тяжелых осложнений путем применения обеднённыхлейкоцитами трансфузионных сред.

Универсальная лейкодеплеция (отношение к технологии в мире)

С начала 90-х годов ведется научная дискуссия о целесообразности универсального удаления лейкоцитов - УУЛ, то есть удаления лейкоцитов из всех доз эритроцитной массы, концентратов тромбоцитов и плазмы. Особенно активно дискуссия велась после внедрения обязательного УУЛ в Великобритании, Кана-де, Новой Зеландии, Франции, Ирландии,Португалии и Люксембурге в период с1998-2000 гг. В дальнейшем к ним присоединились Германия (2001 г.), Япония(2007 г.). В США дискуссия переросла в конфронтацию. С одной стороны, Совет экспертов по безопасности и использованию крови (ACBSA), Совет экспертов по продуктам крови (BRAC), а также подавляющее большинство руководителей университетских клиник США считают, что имеющиеся научные данные являются достаточным основанием для введения УУЛ. С другой стороны, Де-партамент здравоохранения США, также опираясь на мнение ученых и FDA, считает, что для незамедлительного введения УУЛ нет достаточных данных. В настоящее время в США только 80% педиатрических клиник используют универсальную лейкодеплецию, повсеместного распространения УУЛ нет. По данным службы крови Американского Красного Креста, в 2006 г. из 30 044 000 перелитыхв США компонентов крови только 9,9% были лейкоредуцированными перед хранением, 52% подверглись лейкодеплециив конце хранения. Применение метода удаления лейкоцитов из компонентов крови с целью повышения безопасности гемотрансфузий в учреждениях здравоохранения России является обязательным и регламентировано приказами МЗРФ. В 2008 г. в 53 регионах России производилась лейкофильтрация эритроцитсодержащих сред, плазмы и тромбоконцентрата, использовались как отечественные, так и зарубежные лейкофильтры. Однако объем передаваемых в ЛПУ фильтрованных сред невелик и составляет, соответственно 17, 8, 10% от общего объема указанных сред, использованных в клинической практике.

Стандартизация и контроль качества клеточных компонентов крови, обедненных лейкоцитами Непосредственная цель лейкодеплеции - удаление лейкоцитов из компонентов крови с редукцией их содержания дозначения <1 x 106 на 1 трансфузию. Именно такая степень «очистки» трансфузионной среды позволит профилактировать развитие нежелательных реакций, связанных с наличием остаточных лейкоцитов. В Европейских и Российских стандартах качества понятие лейкоредукции соответствует указанному критерию, а в США достаточной является лейкоредукция гемокомпонента до значения 5 x 106 на трансфузию. Мониторинг качества позволяет четко контролировать соблюдение стандартов заготовки и хранения компонентов крови. Для оценки качества эритроцитсодержащих сред в исследовательских целях используются многочисленные характристики. По мнению экспертов Европейского Совета, наиболее актуальными для практической работы являются: объем эритроцитов, гематокри, содержание гемоглобина в дозе и % гемолиза в конце хранения (табл. 1). В настоящее время обязательным элементом практики производства и применения обедненных лейкоцитами компонентов крови является определение количества остаточных лейкоцитов. Контролю качества подвергается 1% компонентов крови, Европейские рекомендации подразумевают, что после валидации методов лейкодеплеции, по крайней мере, 90% трансфузионных сред должны соответствовать критерию качества контаминированности лейкоцитами менее 106 клеток на дозу. В ближайшем будущем аналогичные требования будут предъявляться к трансфузионным средам в России.

Таблица 1

Критерии качества ЕС для донорских эритроцитов

Параметр	Эритроцитная масса	Эритроцитная масса с удаленным ЛТС	Эритроцитная масса фильтрованная
Гематокрит	0,65-0,75	0,65-0,75	0,5-0,7
Остаточные лейкоциты в дозе	-	<1,2 x 109	<1 x 106
Гемоглобин	Минимум 45 г/доза	Минимум 43 г/доза	Минимум 40 г/доза
Гемолиз эритроцитов в конце хранения	< 0,8%	< 0,8%	< 0,8%

Как следует из приведенных в таблице 1 критериев качества ЕС, после фракционирования и удаления ЛТС количество лейкоцитов в дозе эритроцитов не должно превышать 1,2 x 109, после лейкоредукции должно быть менее 1 x 106. Содержание гемоглобина в дозе эритроцитов не должно быть ниже 45 г, количество гемолизированных в конце хранения эритроцитов должно быть менее 0,8%. В процессе фракционирования и удаления из эритроцитной массы ЛТС потери гемоглобина неизбежны, и допускается снижение гемоглобина до 43 г в дозе.В тех дозах эритроцитов, где применена лейкодеплеция, допускается потеря до 5 ггемоглобина и является приемлемым снижение содержания гемоглобина до 40 г в дозе. 

Методы определения остаточных лейкоцитов в компонентах крови

Внедрение в рутинную трансфузионную практику использования компонентов крови, обедненных лейкоцитами,стимулировало разработку технологийи валидацию методов контроля остаточных лейкоцитов в трансфузионных средах. При этом достаточно проблематично оказалось изыскать возможность точного определения остаточного количества лейкоцитов после фильтрации из-за низкого их содержания. Согласно требованиям стандарта качества, содержание остаточных лейкоцитов не должно превышать 106 клеток на дозу, что может быть подтверждено или опровергнуто лишь при использовании аппаратуры с высокой разрешающей способностью. Вначале 90-х гг. наиболее распространеным был ручной способ определения сиспользованием метода световой микроскопии и гемоцитометра большого объема (счетной камеры Nageotte). Способ характеризуется высокой вариабельностью получаемых результатов при межлабораторном сравнении данных и, кроме того, не позволяет провести экспертную оценку качества удаления лейкоцитов из крови и ее компонентов из-за недостаточной чувствительности гемоцитометра .В 1997 г. впервые была продемонстрирована возможность точного определения низкого уровня лейкоцитов в трансфузионной среде методом проточной цитофлюориметрии с использованием антител против общелейкоцитарного маркера CD 45. В настоящее время применяются автоматические методы, основанные на принципах полимеразной цепной реакции и различных вариантах проточной цитофлюориметрии. Последние являются приоритетными из-за высокой скорости выполнения измерений и большей чувствительности (за счет исследования большего объема образца). В предлагемых вариантах обязательным эта помпроведения исследований является соединение определенных структур лейкоцитов с флюоресцирующими красителями. Допустимо применение ДНК-красителей (пропидиум-йодид) или коньюгированных с флюорохромами моноклональных антител против CD-антигенов лейкоцитов. Недостатком автоматических методов анализа по сравнению с ручным способом подсчета остаточных лейкоцитов является их большая стоимость.

Актуальность

Сегодня никто не сомневается в том, что фильтрация компонентов крови крайне необходима, но, несмотря на активное использование в трансфузиологической практике различных методов удаления лейкоцитов из гемокомпонентов, сравни-тельная оценка качества лейкофильтрованных гемокомпонентов остается предметом многочисленных исследований. Выявленные зависимости качества фильтрованных донорских эритроцитов от этапа фракционирования, температуры и длительности предфильтрационного хранения, использования различных видов гемоконсервантов во многом являются дискуссионными и часто носят противоречивый характер. Малое количество опубликованных результатов по сравнительной оценке эффективности лейкоредукции различными фильтрующими системами затрудняет их выбор. В настоящее время в России производятся: система фильтрации лабораторного (банковского) типа «Лейкосеп» Интероко и система ПК 02-01 с 2-мя мешками «Виробан» и встроенным фильтром PALL. По данным российских авторов, использование фильтрующей системы «Лейкосеп» Интероко позволяет достичь в эритроцитсодержащих компонентах крови лейкодеплеции, соответствующей европейскому стандарту. Нет уточненных данных о влиянии температурного режимана результаты фильтрации системой «Виробан». Исследование остаточных лейкоцитов в лейкофильтрованных гемокомпонентах проводилось с использованием счетной камеры Nageotte. Сравнительный анализ качества лейкодеплеции эритроцитной массы российскими системами с использованием автоматических методов контроля остаточных лейкоцитов не проводился.

Цель исследования

Сравнение технических параметров и качества фильтрации системами «Лейкосеп» Интероко и ПК 02-01 с 2-мя мешками«Виробан» (основным элементом которой является встроенный фильтр PALL зарубежного производства) для лейкоредукции эритроцитной массы в первые сутки после заготовки. Оценка влияния температурного режима на качество фильтрации эритроцитной массы системой «Виробан».

Материалы и методы

Дизайн исследования

Исследуемый материал 20 доз эритромассы без ЛТС не охлажденной (t +22°С) 10 доз эритромассы без ЛТС охлажденной (t +4°С)

Фильтрация (при t +22°С) 10 доз системой «Виробан» и 10 доз системой «Лейкосеп» Фильтрация (при t +4°С) 10 доз системой «Виробан»

Время монтажа системы, скорость фильтрации, общее время получения фильтрованных компонентов; Изменения объема эритромассы (потери при фильтрации - изменение веса фильтра).

Группа исследуемых Параметров	1 этап Оценка исходных параметров эритромассы без ЛТС	2 этап Оценка параметров после фильтрации (1 сутки хранения)	3 этап Оценка параметров после фильтрации (7 сутки хранения)
1	2	3	4
Количественные характеристики Эритромассы	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков
Повреждение эритроцитов в процессе фильтрации и хранения	Свободный гемоглобин Осмотическая резистентность Эритроцитов	Свободный гемоглобин Осмотическая Резистентность эритроцитов	Свободный гемоглобин Осмотическая резистентность Эритроцитов
Лейкоредукция	Определение остаточных лейкоцитов методом проточной Цитофлюориметрии	Определение остаточных лейкоцитов методом проточной Цитофлюориметрии

 
 

Расчетные параметры для сравнительной оценки: содержание гемоглобина в дозе; потеря гемоглобина; процент гемолизированных эритроцитов; степень лейкоредукции.

Рис. 1.

Система «Лейкосеп» (устройство предназначено для удаления лейкоцитовиз компонентов консервированной крови (эритроцитной массы и плазмы).

1. Колпачок

2. Игла одноканальная

3. Коннектор для стерильного соединения

4. Защитная оболочка

5. Штуцер

6. Контейнер с плазмой

7. Контейнер с эритроцитной массой

8. Узел фильтрации

9. Роликовый зажим

10. Желтый зажим

11, 13, 18, 19, 21, 22. Трубка

12. Контейнер для безлейкоцитной плазмы

14. Зажим

15. Красный зажим

16. Контейнер для безлейкоцитной эритромассы

17, 20. Белый зажим

Система «Виробан» по своему предназначению может быть использована для лейкоредукции эритроцитов на том же этапе, что и система «Лейкосеп» - непосредственно после фракционирования консервированной крови на компоненты, в связи с чем их сравнение является корректным. Температурный режим фильтрации не указан в руководстве по эксплуатации системы «Лейкосеп», в связи с чем мы дополнительно не охлаждали донорские эритроциты до +4°С и не формировали данную группу наблюдений. При использовании лейкофильтров «Виробан» охлаждение трансфузионной среды до+4°С является обязательным условием, в то время как несоблюдение данного температурного режима может значительно ухудшить результаты фильтрации. На СПК ДЗ г. Москвы удаление лейкотромбоцитарного слоя из эритроцитсодержащих компонентов крови является обязательным этапом фракционирования дозы консервированной донорской кровис целью повышения безопасности трансфузионных сред. Одним из преимуществ лейкофильтрации на этапе после фракционирования дозы консервированной донорской крови на компоненты является возможность заготовки ЛТС как источника получения тромбоцитных концентратов. Для исследования было использовано 30 доз донорской эритроцитной массы (ЭМ) с удаленным лейкотромбоцитарным слоем (ЛТС), которые были распределенына 3 группы по 10 доз. В 1 и 3 группах ЭМс удаленным ЛТС фильтровали системой «Виробан» (рис. 2). Во 2 группе применяли фильтрующие системы «Лейкосеп» (рис.1). Процесс фильтрации в 1 и 2 группах осуществляли непосредственно после фракционирования при температуре +22°С (с нарушением рекомендаций по эксплуатации фильтров ПК 02-01 с 2-мямешками «Виробан»). ЭМ 3 группы перед фильтрацией была выдержана при температуре +4°С от 2-18 ч (согласно рекомендациям по эксплуатации фильтров ПК 02-01 с 2-мя мешками «Виробан»). Контрольную группу составили 10 доз цельной донорской крови, подвергшейся стандартной процедуре фракционирования до ЭМ с удалением ЛТС и дальнейшим хранением при температуре +4°С в течение 7 суток. Средний возраст донора был 30 лет. По полу и возрасту группы не различались.

Рис. 2.

Система «Виробан» (фильтрующим узлом которой является встроенныйфильтр PALL зарубежного производства) - устройство предназначено дляудаления лейкоцитов из эритроцитной массы, эритроцитной взвеси илицельной консервированной крови.

1. Колпачок защитный

2. Игла полимерная

3, 7, 8, 10, 13. Трубка соединительная

4. Y-коннектор

5. Клапан односторонний

6. Фильтр лейкоцитарный

9, 14. Зажим малый

11, 12. Контейнер крови

Исследовали технические параметры фильтрации, регистрировали скорость фильтрации и общее время получения компонента. Потери донорских эритроцитов определяли по изменению веса фильтра до и после фильтрации. Исследование проводили в 3 этапа: до фильтрации, непосредственно после фильтрации и на 7 сутки хранения эритроцитов при температуре +4°С. В случае с контрольной группой проводили оценку параметров до фракционирования (в цельнойкрови), после фракционирования и получения ЭМ без ЛТС и на 7 сутки храненияданной трансфузионной среды. Длительность хранения 7 дней была выбрана неслучайно, именно в таком «возрасте» поступают в клинику со станции переливания крови и проводится трансфузия большинства донорских эритроцитов, кроме того, ограничение конца срока хранения эритроцитов 7 сутками позволило провести исследование более компактно по времени. Сравнительную оценку качества полученных в процессе фильтрации компонентов крови определяли по 3 группам параметров.

1. Количественные характеристики трансфузионных сред:

определение гематокрита и концентрации Нв в эритроцитной массе выполняли на гематологическом анализаторе «ADVIA2120» (фирмы Siemens). В последующем рассчитывали содержание гемоглобина в дозе и потери гемоглобина в процессе фракционирования и фильтрации. По-скольку любой гематологический ана-лизатор позволяет измерить в пределахразрешающей способности количестволейкоцитов и тромбоцитов, мы также ис-пользовали эти данные для сравнениягрупп до фильтрации с контрольной группой.

2. Степень повреждения эритро-цитов в процессе фильтрации и хранения:

свободный гемоглобин определяли наанализаторе фирмы «НemoСue AB». В последующем рассчитывали процент гемолизированных эритроцитов, используя формулу: % гемолиза =Нв свободный г/л (1-Ht об/об) х 100Нв общий г/л

3. Степень лейкоредукции и количество остаточных лейкоцитов: в России подсчет остаточных лейкоцитовв трансфузионных средах был возможентолько в камере Нажотта. Предлагаемые методы автоматизированной оценки (проточной цитофлюориметрии) до 2010 г. не были зарегистрированы. Отсутствие валидированных современных методов подсчета остаточных лейкоцитов накладывает определенные трудности в проведении независимой экспертной оценки качества компонентов крови, способов ее фракционирования с применением фильтрующих систем, это особенно важно в случае появления на рынке новых фильтров от различных производителей. Способ с использованием антител против общелейкоцитарного маркера CD45 является быстрым в исполнении и минимально трудоемким методом оценки количества лейкоцитов в крови. В настоящее время для определения точного количества исследуемых клеток существуют технологии с применением наборов Kit Flow-Count Fluorospheres фирмы «BECKMANCОULTER» и Kit Tru-Count Fluorospheres фирмы «Becton Dickinson». Методики зарегистрированы и широко применяются в России. Мы использовали аппарат FC 500 (фирмы «BECKMAN CОULTER»). Для точного определения абсолютного количества лейкоцитов в пробе эритроцитной массы применяли набор Kit Flow-Count Fluorospheres и моноклональные антитела против общелейкоцитарного маркера CD45.

Статистическая обработка

Статистическая обработка данных производилась методами вариационной статистики с применением программного комплекса MEDCALC. Описательная статистика данных, выраженных в виде количественных показателей, приведена в виде среднего арифметического значения M и его стандартной ошибки m ввиде M±m и медианы. Перед проведением статистического анализа данных была произведена проверка количественных показателей на соответствие нормальному (гауссовому) распределению значений при помощи критериев согласия Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Во всех изученных группах нормальность распределения не была доказана, в связи с чем для статистической обработки применялись непараметрические критерии. Сравнение двух групп производилось непараметрическим критерием Манна-Уитни, сравнение нескольких групп-непараметрическим дисперсионным анализом по Крускалу-Уоллису с последующим применением post-hoc анализа по Данну. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования

Согласно дизайну, на 1 этапе исследования изучены количественные характеристики эритроцитсодержащих сред. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, все дозы эритроцитов соответствовали критерию качества биологической полноценности ЕС и содержали более 45 г Нв в дозе. В дозах эритроцитов 2 и 3 групп Нt составил соответственно 76и 79% и был выше чем в 1 и контрольнойгруппах. Содержание Нв в дозе эритроцитов составило по 63 г во 2 и 3 группах и было больше (р=0,014) чем в 1 группе (50г/л), что очевидно было связано с меньшим объемом и меньшей концентрацией Нв в трансфузионных средах 1 группы, что было учтено при последующем анализе. Исследуемые группы по содержанию Нв не отличались от контрольной группы.

Подсчет лейкоцитов в эритроцитсодержащих средах до фильтрации осуществили параллельно на проточном цитофлюориметре и гематологическом анализаторе, чувствительность которого позволяла определить их количество в диапазоне 108-109 /л. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, исследуемые группы не отличались между собой и от контрольной группы по контаминированности лейкоцитами послеу даления ЛТС, хотя их количество быловыше рекомендованного экспертамиЕС. Мы наблюдали сходство в результатах подсчета лейкоцитов до фильтрацииобоими методами. Установлена высоко-достоверная сила связи между результатами подсчета лейкоцитов на гематологическом анализаторе и при проточной цитофлюориметрии в корреляции Спирмена (рис. 3). Выявленная связь между параметрами характеризует высокую точность подсчета лейкоцитов в данном диапазоне обоими методами, в связи счем при необходимости определения количества лейкоцитов в эритроцитарной трансфузионной среде без лейкоредукции возможно обойтись использованием обычного гематологического анализатора, прошедшего процедуру валидации.

Сравнительная оценка технических параметров фильтрации

Проведены сравнение и оценка технических характеристик фильтрации (время монтажа системы, скорость фильтрации,изменение веса фильтра и общее время получения компонента крови). Время монтажа системы в 1 группе составило 50 с, во 2 и 3 группах по 30 с (за счет меньшего числа зажимов). В связи с тем, что время монтажа фильтрующей системы занимало менее 1 минуты работы оператора, вобщем времени получения компонента его учитывать не стали. Как следует из таблицы 3, процесс фильтрации системой «Лейкосеп» был более длительным - 20мин (p< 0,05), чем в во 2 и 3 группах, где длительность фильтрации и общее время получения компонента составили по 14 мин. Время фильтрации регистрировалось с учетом обратной петли. Ни в одном случае не зарегистрировано удлинение фильтрации более заявленного времени для данных типов фильтров.

Таблица 2

Количественные характеристики компонентов крови до фильтрации

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп	Контроль эр масса без ЛТС
Ht, об/об	M=70,54 (95% ДИ: 67,7- 73,38) Me=70,5 (МКД: 67,15- 73,4)	M=77,04 (95% ДИ: 73,91- 80,17) Me=76,75 (МКД: 73,55- 78,1)	M=76,97 (95% ДИ: 71,18- 82,76) Me=79,5 (МКД: 70,67- 81,25)	0,017	1 и 2 1 и 3	M=68,1 (95% ДИ: 65,44- 70,76) Me=69,0 (МКД: 65,85- 70,35)
Нв, г/л	M=247 (95% ДИ: 237,12- 256,88) Me=244,5 (МКД: 237,5- 255,5)	M=266,4 (95% ДИ: 256,78- 276,02) Me=264,5 (МКД: 257- 272,25	M=251,7 (95% ДИ: 233,37- 270,03) Me=255,5 (МКД: 232,75- 262,25)	0,0 52	-	M=228 (95% ДИ: 220,87- 235,13) Me=231,5 (МКД: 221- 235,75)
Содержание Нв в дозе, г/доза	M=51,9 (95% ДИ: 46,94- 56,86) Me=50,5 (МКД: 47,5- 57,25)	M=62,4 (95% ДИ: 56,55- 68,25) Me=63,5 (МКД: 57,5- 67,5)	M=63,4 (95% ДИ: 56,53- 70,27) Me=63 (МКД: 54,75- 68)	0,014	1 и 2 1 и 3	M=57,02 (95% ДИ: 51,66-62,38) Me=54,6 (МКД: 51,05- 63,95)
Подсчет на ADVIA 2 120M (гематологический анализатор
Лейкоциты, х109/доза	M=1,39(95% ДИ:1,05-1,73) Me=1,23 (МКД: 1,1025- 1,506)	M=1,58 (95% ДИ: 1,26-1,9) Me=1,638 (МКД: 1,295375- 1,977375)	M=2,05 (95% ДИ: 1,53-2,57) Me=2,019 (МКД: 1,716- 2,57825)	0,18 5	-	M=2,04 (95% ДИ: 1,46- 2,62) Me=1,95 (МКД: 1,446- 2,2798)
Подсчет на FC 500 (проточная цитофлюориметрия)
Лейкоциты, х109/доза	M=1,38 (95% ДИ: 1,1-1,67) Me=1,248 (МКД: 1,181- 1,517)	M=1,96 (95% ДИ: 1,13-2,78) Me=1,654 (МКД: 1,394- 1,802)	M=2,1815 (95% ДИ: 1,54-2,81) Me=2,057 (МКД: 1,544- 3,011)	0,127	-	Нет анализа

В 1 и 3 группах («Виробан») трудозатраты были минимальными. Было достаточно двух подходов оператора к каждому фильтру для запуска фильтрации и использования обратной петли, в связи с чем время фильтрации соответствовало общему времени получения компонентакрови. Во 2 группе («Лейкосеп») процесс фильтрации разделялся на 4 этапа: фильтрация плазмы, перевод эритромассы без ЛТС в контейнер из-под плазмы, фильтрация эритромассы, применение обратной петли. Процесс фильтрации требовал значительных трудозатрат и общее время получения компонента крови было равным 28 мин, что гораздо более длительно (р=0,001), чем в 1 и 3 группах. Таким образом, длительность фильтрации была значительно больше во 2 группе. Трудозатраты были выше также во 2 группе. Данные различия обусловлены тем, что через «Лейкосеп» пропускается в 2 раза больший объем среды - плазма и ЭМ, однако при этом заготавливается 2 лейкоредуцированных компонента крови. Потери при фильтрации, определяемые по весу фильтра, в 1 и 3 группах были минимальными и составили соответственно 24 и 21 мл, во 2 группе были выше (р<0,001) и составили 38 мл.

Рис. 3.

Связь между результатами подсчета концентрации лейкоцитов в Эрмассе до лейкодеплеции на ADVIA2 120М и FC 500 («BECKMAN CОULTER»). Коэффициент корреляции (непараметрический коэффициент Спирмена ρ) =0,75 (Р<0,0001)

Таблица 3

Оценка технических параметров фильтрации

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп
Время фильтрации, мин	M=14 (95% ДИ: 11,62-16,38) Me=14 (МКД: 12,25- 15,5)	M=19,2 (95% ДИ: 15,56- 22,84) Me=20,5 (МКД: 15-23)	M=14,9 (95% ДИ: 11,15-18,65) Me=14,5 (МКД: 10,25- 17,25)	0,0 31	1 и 2
Скорость фильтрации, мл/мин	M=15,6 (95% ДИ: 13,57-17,63) Me=15 (МКД: 13,5- 17,75)	M=12,9 (95% ДИ: 9,88-15,92) Me=12 (МКД: 10-15,25)	M=18,6 (95% ДИ: 14,8-22,4) Me=19 (МКД: 15,25-22)	0,0 36	2 и 3
Общее время получения компонента, мин	M=14 (95% ДИ: 11,62-16,38) Me=14 (МКД: 12,25- 15,5)	M=25,9 (95% ДИ: 21,79-30,01) Me=28 (МКД: 20,25-30)	M=14,9 (95% ДИ: 11,15-18,65) Me=14,5 (МКД: 10,25- 17,25)	0,0 01	1 и 2 2 и 3
Потери эритроцитов (вес фильтра), г	M=24,5 (95% ДИ: 22,71-26,29) Me=24,5 (МКД: 23-25)	M=36,8 (95% ДИ: 34,02- 39,58) Me=38 (МКД: 37,25-38)	M=21,3 (95% ДИ: 17,42-25,18) Me=21 (МКД: 18,25- 25,75)	0	1 и 2 2 и 3

Сравнительная оценка количественных характеристик и повреждения эритроцитов после фильтрации эритромассы

При исследовании параметров, характеризующих донорские эритроциты после фильтрации, выявлены следующие изменения: показатель гематокрита и концентрация гемоглобина практически не изменились в 1 и 3 группах и значимо снизились во 2 группе. Содержание Нв в дозе эритроцитов после фильтрации также оказалось самым низким (р=0,001) во 2 группе - 43 г, в сравнении с 1 и 3 группами, где он составил соответственно 45 и 58 г на дозу (табл. 4). При расчете потерь гемоглобина выявлено (рис. 4), что содержание гемоглобина в дозе ЭМ снизилось в среднем на 13 г, тогда как во 2 и 3 группах утрата Нв в процессе фильтрации ЭМ была значительно ниже (Р<0,001) и составила соответственно 2,5 и 3,5 г на дозу. Для сравнения на диаграмме также приведена контрольная группа и потеря эритроцитов, неизбежно возникающая при удалении ЛТС. Из диаграммы следует, что в процессе фракционирования консервированной крови до ЭМ без ЛТС медиана потерь эритроцитов составляет 6 г на дозу, при очень значительных колебаниях от 1 до 11 г на дозу, что в принципе характеризует человеческий фактор при исключительно ручном удалении ЛТС. 

Сравнительная оценка повреждения эритроцитов в процессе фильтрации продемонстрировала почти в 2 раза более низкую, не отличающуюся от контрольной группы концентрацию свободного гемоглобина в конце хранения в ЭМ 2группы (1,25 г/л против 3 и 2,75 г/л в 1 и 3 группах) (р=0,01). Это свидетельствует о минимальном повреждении эритроцитов при использовании системы «Лейкосеп», однако группы не отличались (Р=0,368) по проценту гемолизированных эритроцитов в дозах, и ни в одном из наблюдений этот показатель не приближался к предельно допустимой величине - 0,8% (табл. 4).

Таблица 4

Количественные характеристики и повреждение эритроцитовв процессе фильтрации и хранения

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп	Контроль
Ht, об/об	M=71,91 (95% ДИ: 68,33-75,49) Me=72,3 (МКД: 69,45- 75,85)	M=63,06 (95% ДИ: 56,65-69,47) Me=66,2 (МКД: 57,25- 69,85)	M=78,23 (95% ДИ: 72,9-83,56) Me=79,05 (МКД: 72,9- 84,775)	0,0 02	1 и 2 2 и 3	M=68,1 (95% ДИ: 65,44-70,76) Me=69 (МКД: 65,85-70,35)
Нв, г/л	M=250,9 (95% ДИ: 240,75- 261,05) Me=247,5 (МКД: 241,25-263)	M=222,1 (95% ДИ: 201,35- 242,85) Me=235,5 (МКД: 203,75-241)	M=260,3 (95% ДИ: 243,48- 277,12) Me=258,0 (МКД: 245,25-282)	0, 0 10	1 и 2 2 и 3	M=228 (95% ДИ: 220,87- 235,13) Me=231,5 (МКД: 221- 235,75)
Нв, г/доза	M=46,7 (95% ДИ: 41,99- 51,41) Me=45,0 (МКД: 43-52)	M=43 (95% ДИ: 38,71- 47,29) Me=43,0 (МКД: 41- 45,5)	M=60 (95% ДИ: 53,95- 66,05) Me=58,5 (МКД: 53,5- 67,5)	0,0 01	1 и 3 2 и 3	M=57,02 (95% ДИ: 51,66-62,38) Me=54,5725 (МКД: 51,05375- 63,955)
% гемолиза 7 сут. Хранения	M=0,27 (95% ДИ: 0,15- 0,39) Me=0,21 (МКД: 0,135- 0,3975)	M=0,14 (95% ДИ: 0,09- 0,19) Me=0,135 (МКД: 0,09- 0,1825)	M=0,27 (95% ДИ: 0,14-0,4) Me=0,22 (МКД: 0,1825-0,32)	0,3 68	-	M=0,18 (95% ДИ: 0,08-0,28) Me=0,12 (МКД: 0,08- 0,26)

Рис. 4.

Потеря Нв (количество грамм на дозу) после фильтрации

Рис. 5.

Содержание свободного гемоглобина в эритромассе, обеднённой
лейкоцитами, на 7 сутки хранения

Сравнительная оценка качества лейкодеплеции (подсчёт количества остаточных лейкоцитов и определение коэффициента фильтрации) при использовании систем «Лейкосеп» и «Виробан»Большинство доз ЭМ фильтрованных системой «Лейкосеп» продемонстрировали низкую лейкоредукцию. В 8 дозах контаминация лейкоцитами колебалась от 1,5 до 7 х 106, в одной из доз ЭМ количество лейкоцитов составило 13,8 х 106. Удачным можно назвать лишь 1 наблюдение из 2 группы с редукцией лейкоцитов в ЭМ до 0,8 х 106. Медиана содержания остаточных лейкоцитов во 2 группе была 3,75 х 106 на дозу (табл. 5). В 1 группе после фильтрации системой «Виробан» при несоблюдении температурного режима +4°С эффективная лейкодеплеция достигнута при фильтрации 2 доз ЭМ (0,4 и 0,5 х 106), в остальных случаях количество остаточных лейкоцитов находилось в интервале от 1,05 до 6 х 106, в одном случае наблюдалась очень высокая контаминация 73 х 106 на дозу. Медиана подсчета остаточных лейкоцитов ЭМ 2 группы составила 3,85 х 106 и значимо от 1 г руппы не отличалась. В 3 группе 9 из 10 доз соответствовали эффективной лейкодеплеции с абсолютным числом остаточных лейкоцитов в дозе ЭМ менее 1 х 106, в одном наблюдении количество лейкоцитов оказалось равным 1,34 х 106. Контаминация ЭМ лейкоцитами после фильтрации системой «Виробан» при соблюдении температурного режима +4°С в 3 группе составила 0,25 х 106, что соответствовало в 10 раз более эффективной лейкодеплеции (р=0,001), чем после применения системы «Лейкосеп» (рис. 6).

Таблица 5

Параметры лейкоредукции эритромассы, массы обедненной лейкоцитами, после применения систем «Лейкосеп» и «Виробан»

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп
Концентра- ция лейкоци- тов, х 109/л после филь- трации (1 сут.)	M=0,05 (95% ДИ: -0,03-0,13) Me=0,0215 (МКД: 0,0055- 0,02975)	M=0,02 (95% ДИ: 0,01-0,03) Me=0,02 (МКД: 0,012- 0,0285)	M=0,00187 (95% ДИ: 0,0065- 0,0008) Me=0,00105 (МКД: 0,000925- 0,0019)	0,0 01	1 и 3 2 и 3
Остаточные лейкоциты после филь- трации, х106 (1 сут.)	M=10,08 (95% ДИ: -5,93-26,09) Me=3,85 (МКД: 1,1125- 5,175)	M=4,57 (95% ДИ: 1,9-7,24) Me=3,75 (МКД: 2,125-5,5)	M=0,42 (95% ДИ: 0,16-0,68) Me=0,255 (МКД: 0,205- 0,455)	0,0 01	1 и 2 2 и 3
Лейкоредук- ция (log)	M=2,3 (95% ДИ: 1,82-2,78) Me=2 (МКД: 2-3)	M=2,1 (95% ДИ: 1,69-2,51) Me=2 (МКД: 2-2)	M=3,3 (95% ДИ: 2,95-3,65) Me=3 (МКД: 3-3,75)	0,0 01	1 и 3 2 и 3
% удаления Лейкоцитов	M=99,37 (95% ДИ: 98,49-100,25) Me=99,72 (МКД: 99,565- 99,93)	M=99,12 (95% ДИ: 98,22-100,02) Me=99,71 (МКД: 98,925- 99,8775)	M=99,98 (95% ДИ: 99,96-100) Me=99,99 (МКД: 99,98- 99,99)

Рис. 6.

Содержание остаточных лейкоцитов в эритромассе, обедненной лейкоцитами (подсчет методом проточной цитофлюориметрии c антителами к CD45)

Обсуждение

Универсальная лейкодеплеция не является стандартом для многих стран. С одной стороны, такие доказанные эффекты применения обедненных лейкоцитами компонентов крови как профилактика фебрильных реакций, снижение риска аллоиммунизации и трансмиссии вирусов группы герпеса, повышение иммунологической безопасности трансфузии явлются бесспорными преимуществами технологии. Эффективность лейкодеплециипродемонстрирована у кардиохирургических больных, в онкогематологии, акушерстве и неонатологии. С другой стороны, это дополнительные финансовые и трудозатраты. Не полностью ясна роль лейкофильтрации в повреждении эритроцитов и влиянии на клиническую эффективность трансфузий, нет унифицированных методик и рандомизированных исследований, сравнивающих качество различных систем для лейкодеплеции компонентов крови. Возможно, поэтому исследования качества фильтрации остаются очень актуальными по сей день. Наиболее спорным является вопрос контроля контаминации компонентов крови остаточными лейкоцитами после фильтрации. Точность оценки предлагаемых технологий всё ещё не бесспорна. По данным литературы,имеются противоречивые данные и значительные колебания в результатах «очищения» трансфузионных сред от лейкоцитов и тромбоцитов. Мы применили автоматический способ оценки остаточных лейкоцитов методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител против общелей коцитарного маркера CD45. Других автоматических методов оценки количества лейкоцитов в очень низкой концентрации на момент проведения исследования в России не было зарегистрировано. Выявленная до-стоверная корреляция между результатами подсчета лейкоцитов в эритроцитной массе до фильтрации на аппаратах ADVIA2 120M и FC 500 позволяет предположить отсутствие необходимости применения значительно более дорогого метода проточной цитометрии в сравнении с гематологическим анализатором для контроля качества всех клеточных компонентов крови, не подвергшихся лейкодеплеции. Было бы интересно оценить эргономичность и возможность использования данной методики для независимой экспертной оценки качества трансфузионных сред, а также сравнить чувствительность этого метода и провести сравнительный фармакоэкономический анализ с другими технологиями - подсчетом в камере На-жотта и детекцией остаточных лейкоцитов в проточной цитофлюориметрии по выявлению ДНК с применением красителя пропидиум йодида. В нашем исследованиизарегистрирован более высокий уровеньсвободного гемоглобина в фильтрован-ных эритроцитах в сравнении с работамидругих авторов. Возможно, это связано с применением методики его определения в анализаторе фирмы «НemoСueAB», которая пока не валидирована для исследования качества трансфузионных сред. Температурный режим имеет значение для любой фильтрующей системы. В настоящее время мы не имели технической возможности провести оценку влияния температурного режима на качество фильтрации системой «Лейкосеп», однако это целесообразно сделать в ближайшем будущем, применив современные методы подсчета остаточных лейкоцитов.

Заключение

При эксплуатации системы «Лейкосеп» (температура трансфузионной среды составляла +22°С) было продемонстрировано минимальное повреждение эритроцитов, но большая их потеря в процессе фильтрации, при этом недостаточная лейкодеплеция имела место в 90% наблюдений. Успешность применения системы «Виробан» зависела от четкого соблюдения температурного режима (охлаждение ЭМ перед фильтрацией до +4°С), при этом эффективность лейкоредукции эритроцитной массы была на порядок выше и соответствовала стандарту качества в 90% наблюдений.