С.Д. Волкова, В.Н. Чеботкевич, Г.Ю. Кирьянова, Е.И. Кайтанджан, В.В. Бурылев, Т.А. Матвеева, М.В. Беркос, А.В. Чечеткин
ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург
Трансфузиология №1, 2015
Резюме
Изучали распространенность и активность герпесвирусных инфекций у 570 доноров, 580 онкогематологических больных и 41 ребенка с соматическими заболеваниями. Установлена частота ЦМВ-серонегативных доноров и определена клиническая потребность в ЦМВ-негативных гемокомпонентах. Разработаны алгоритмы обследования доноров и больных с целью снижения риска трансмиссии ЦМВ при проведении гемокомпонентной терапии.
Ключевые слова: доноры, иммуносупрессивные больные, цитомегаловирус, гемокомпоненты, гемотрансмиссивные инфекции.
Введение
Вирусная безопасность гемотрансфузионной терапии – один из ключевых аспектов современной трансфузиологии. Особенностями инфекций, вызванных вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ 1, 2), вирусом Эп- штейна–Барр (ВЭБ); цитомегаловирусом (ЦМВ), вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6), являются их широкая распространенность (60–80%), склонность к длительной персистенции возбудителей в клетках крови и тканях организма [1–3] с периодами реактивации и развитием тяжелых осложнений у больных, особенно при иммуносупрессиях [4–7]. Из указанных возбудителей наиболее значимым инфекционным агентом, связанным с гемотрансфузиями, является цитомегаловирус [8–10], оказывающий выраженное патогенное влияние на иммунокомпетентные клетки крови [11], а также служащий причиной врожденной патологии и инвалидизации новорожденных [12–14].
При переливании крови, содержащей геном ЦМВ, у иммуносупрессивных больных возможно возникновение острой формы инфекции с тяжелыми осложнениями и летальным исходом [1, 4, 6, 7, 13]. Тяжесть течения цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) и ее латентный характер отчасти обусловлены поражением не только мононуклеаров периферической крови, но также CD34+-предшественников и миелоидных клеток [2, 10, 11].
Высокий риск развития ЦМВИ (до 60–80%) отмечается при трансплантации органов (почек), особенно при сочетании серопозитивного донора и серонегативного реципиента. Кроме того, в данных условиях значительно снижается приживаемость трансплантата. ЦМВИ возникает у серопозитивных реципиентов в связи с попаданием в организм с донорской почкой нового штамма ЦМВ, либо с реактивацией собственного латентного вируса на фоне иммуносупрессии [15]. В то же время в литературе имеются сведения о том, что ЦМВ серонегативный донор при трансплантации также может представлять опасность для серопозитивного реципиента [3, 16], особенно на фоне дефицита Т-клеточного иммунитета [17]. Гемотрансмиссивная инфекция может развиваться у иммуносупрессивных реципиентов, несмотря на использование серонегативных или лейкоредуцированных гемокомпонентов, в случае, если донация у донора совпала с периодом «серологического окна» [3, 12]. При неустановленной первичной ЦМВИ у донора на фоне отсутствия IgG-антител возможно нахождение генома вируса как в клетках крови, так и в плазме, что делает неэффективной лейкодеплецию. По данным M. Ziemann, S. Krueger [16], частота выявления специфической ДНК цитомегаловируса в гемокомпонентах составляет 0,13%.
Реактивация ЦМВ при неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) может быть обусловлена не только длительной и тяжелой иммуносупрессией, Т-клеточной деплецией трансплантата, развитием реакции «трансплантат против хозяина», но также и серологическим ЦМВ-статусом донора и реципиента [18].
Имеются сведения об отсутствии признаков ЦМВИ в 100% случаев как при аллогенных, так и при аутологичных трансплантациях костного мозга от ЦМВ-серонегативных доноров [28]. В настоящее время имеется достаточное число работ, где обосновывается необходимость отбора ЦМВ-серонегативных доноров для снижения риска гемотрансмиссивных инфекций [7, 15] и отмечается недостаточность применения только методов лейкоредукции [10, 19–21]. Несмотря на утвержденные нормативы «безопасной лейкодеплеции» (<1–5×106 остаточных лейкоцитов в дозе), условное определение минимально допустимой ЦМВ-вирусной нагрузки (<500 ГЭ/мл) [22–25] вопросы эффективной профилактики гемотрансмиссивных лейкоцитассоциированных вирусных инфекций продолжают дискутироваться [19, 22].
В основополагающих инструктивных документах [17, 24, 26] определены группы риска реципиентов гемотрансфузий: новорожденные дети, беременные женщины, реципиенты аллогенных трансплантатов, ВИЧ-инфицированные, иммуносупрессивные онкологические больные.
Перечень вирусов, подлежащих обязательному контролю в службе крови России, ограничен ВИЧ 1 и 2; ВГВ и ВГС. В то же время в ряде других стран (США, Германия, Австрия, Франция и др.) для больных группы риска включено обследование на ЦМВ как серологическим (ИФА), так и молекулярно-биологическим (ПЦР) методом [26–28]. При этом отмечается, что ПЦР не может полностью заменить ИФА, позволяющего определять предранние, низкоавидные антитела к корпускулярным и ядерным антигенам [29], выявлять маркеры острой фазы ЦМВИ, а также оценивать динамику титров антител. В частности, индекс авидности IgG к поздним антигенам позволяет дифференцировать первичную инфекцию и реактивацию латентной, а увеличение титра IgG в 4 раза и более имеет клиническое значение [15]. Для исключения риска гемотрансмиссивной передачи вирусов в период «серологического окна» у донора целесообразно одновременное использование обоих (ИФА и ПЦР) диагностических методов [28]. При вирусоносительстве (отсутствии активной инфекции) ЦМВ присутствует только в лейкоцитах и в очень малом количестве (1 вирусная частица на несколько тысяч лейкоцитов). Диагностика в таких случаях возможна только с использованием высокочувствительных тест-систем на основе ПЦР [5]. О необходимости расширения спектра исследуемых вирусных маркеров свидетельствует ряд работ, проведенных отечественными учеными. Т.А. Гаранжа с соавт. [30], отмечая отсутствие в России практики тестирования доноров на ЦМВ, при обследовании 500 доноров выявили методом ИФА признаки активной ЦМВ и ВЭБ инфекции, в 2 и 13% соответственно. Методом ПЦР в крови были обнару- жены геномы ЦМВ (2%) и ВЭБ (27%). Это подтверждает наличие опасности инфицирования реципиентов.
В работе А.Д. Касьянова с соавт. [31] приведены сведения о выявлении методом ИФА у доноров, наряду с IgG+-антителами к ЦМВ (68,9%) и ВЭБ (74,3%), признаков реактивации инфекции ЦМВ (1,1%) и ВЭБ (32%). Авторы считают необходимым введение практики серологического тестирования на герпесвирусы для получения серонегативных гемокомпонентов, а также для исключения серопозитивных донаций при обнаружении маркеров активации инфекции. При обследовании 350 кадровых доноров Н.А. Федоров и соавт. [5] методом ПЦР выявили 6,5% доноров – носителей генома ЦМВ в крови. По данным M. Elfath и соавт. [32], серонегативные доноры (доля которых составила 25–30%) не содержали в крови ДНК ЦМВ, в то время как у серопозитивных доноров геном ЦМВ был обнаружен в 15% случаев. По их мнению, кровь серопозитивных доноров, не содержащая генома ЦМВ, также может быть использована без риска инфицирования ЦМВ-негативных пациентов, особенно если она подвергается фракционированию с лейкоредукцией. В то же время D.J. Greenleе с соавт. [33] приводят данные об отсутствии генома ЦМВ в гемокомпонентах, полученных из крови 103 серонегативных и 250 серопозитивных доноров.
Таким образом, анализ данных литературы указывает на целесообразность тестирования донорской крови на герпесвирусы и, главным образом, на ЦМВ методами ИФА и ПЦР с целью снижения частоты инфицирования
реципиентов «группы риска».
Материалы и методы исследования
Материалами исследования служили сыворотка крови, кровь и мазки со слизистой полости рта доноров (n = 570), гематологических больных (n = 580) и детей с соматическими заболеваниями (n = 41).
Для определения распространенности и активности герпесвирусов (ЦМВ, ВЭБ, ВПГ 1,2 и ВГЧ-6), использовали следующие методы:
– молекулярно-биологический (ПЦР качественная и ПЦР в реальном времени) с применением наборов реагентов для выявления ДНК вируса в клиническом материале с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Ампли Сенс – CMV», «Ампли Сенс – EBV», «Ампли Сенс – HSVI, II», «Ампли Сенс - HHV-6» ООО «ИнтерЛабСервис» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора согласно инструкциям фирмы-производителя. Чувствительность определения вирусной ДНК составляла 1000 ГЭ/млн кл для крови и 1000 ГЭ/мл для слюны;– иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием наборов реагентов фирмы «Вектор-Бест» (для определения IgG, IgM, IgG IEA к ЦМВ и IgG, IgM, IgG EA к ВЭБ), а также коммерческих диагностических наборов реагентов для выявления иммуноглобулинов класса G и М к цитомегаловирусу, зарегистрированных и разрешенных МЗ РФ к применению на территории Российской Федерации (ARCHITECT-АТ plus, в том числе ARCHITECT-АТ IgM, ARCHITECT-АТ IgG, ARCHITECT-АТ IgG-авидность, ЗАО «Вектор-Бест»).
Результаты и обсуждение
Проведен анализ частоты распространения герпесвирусной инфекции (ЦМВ, ВЭБ, ВПГ 1,2; ВГЧ-6) и ее активности у доноров ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России за 2011–2014 гг. Обследовано 570 доноров, из которых 85,4% – доноры тромбоцитафереза (34,7% – аппаратного и 40,7% – дискретного). Результаты молекулярно-биологического исследования (ПЦР в реальном времени) геномов герпесвирусов в крови и мазках со слизистой полости рта приведены в табл. 1.
Обращает на себя внимание отсутствие генома ЦМВ во всех пробах, в то время как частота выявления ВЭБ составила 4,2% в крови и 28,9% в мазках, ВГЧ-6 – 2,8% в крови и 6,0% в мазках.
Серологический статус доноров оценивали методом ИФА по характеру специфических антител к наиболее клинически значимым представителям вирусов группы герпеса, а именно ЦМВ и ВЭБ. Всего методом ИФА обследовано 529 доноров. При этом наибольшее внимание было уделено выявлению лиц, не имеющих признаков инфицирования (серонегативные доноры) и маркеров активной инфекции (первичное инфицирование или реактивация). Результаты обследования приведены в табл. 2.
Иммуноферментный анализ сыворотки донорской крови позволил выявить 11% доноров, серонегативных к ЦМВ, и 1,9% – к ВЭБ.
Иммуноглобулины класса IgM к ЦМВ обнаружены в 9,3%, а IgG IEA (G и M) – в 4,5% из всех исследованных образцов. Близки по частоте и результаты ИФА-тестирования на антитела к ВЭБ (IgM в 4,9% и IgG EA в 7,6%).
При анализе индивидуальных показателей установлено, что маркеры активной ЦМВ-инфекции выявлены у 71 донора (13,4% от общего числа).
В том числе признаки активной ЦМВ-инфекции в подгруппе серонегативных доноров были у 10,3%, а в подгруппе серопозитивных – у 13,8%. Количество доноров с маркерами активной ВЭБ-инфекции составило 12,1% (все в подгруппе серопозитивных по ВЭБ).
Основным результатом серологического тестирования явилась возможность выделить группы ЦМВ- и ВЭБ серонегативных доноров, которые подлежат учету в донорском реестре и должны обследоваться в динамике при повторной явке на кроводачу, в случае необходимости переливания серонегативному реципиенту.
Обобщенные данные о частоте выявления геномов герпесвирусов у 580 больных гематологической клиники ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России приведены в табл. 3 и 4.
Учитывая обобщенные данные ПЦР-тестирования материалов от больных, следует отметить высокую инфицированность вирусом Эпштейна-Барр (12,3% в крови, 31,2% – в мазках), а также ВГЧ-6 и цитомегаловирусом (4,2 и 4,1% в крови соответственно), что может свидетельствовать как о реактивации собственных вирусов на фоне иммуносупрессивной терапии, так и о трансмиссии их с гемокомпонентами.
Представленные в табл. 4 результаты ИФА свидетельствуют о наличии среди гематологических больных пациентов, серонегативных по ЦМВ (5%) и ВЭБ (0,4%), нуждающихся в соответствующем подборе гемокомпонентов.
Часть больных (6,5% по ЦМВ и 11,1% по ВЭБ) имела серологические признаки активной инфекции.
Частота ЦМВ-серонегативности в различных группах наблюдения приведена на диаграмме (рис. 1). Обращает внимание высокий процент ЦМВ-серонегативных пациентов в детской группе, в возрасте от 1 до 10 лет (55,9%), что должно учитываться в педиатрической практике, а также необходимость обеспечения гематологической клиники ЦМВ-серонегативными гемокомпонентами (5% клинических наблюдений).
По результатам выполненных исследований составлены алгоритмы обследования больных (рис. 2) и доноров (рис. 3), в которых приведен порядок обследования, варианты подбора пар «донор–реципиент» по результатам ИФА и ПЦР, рассмотрены особенности тактики при проведении гемокомпонентной терапии у реципиентов «группы риска» и предложены варианты использования ЦМВ-негативных эритроцитных средств, плазмы и ТК.
Следует обратить внимание на возможность переливания гемокомпонентов ЦМВ-серопозитивного донора серонегативному реципиенту (при обязательном подтверждении отсутствия ДНК цитомегаловируса в крови донора
методом ПЦР real time на момент донации), что значительно расширяет возможности обеспечения ЦМВ-серонегативных больных компонентами крови.
Заключение
В результате обследования 570 доноров выявлено 11% ЦМВ-серонегативных доноров по данным ИФА, а также доказано отсутствие генома ЦМВ в клетках крови (ПЦР ниже порогового уровня) в 100% случаев на момент кроводачи, что позволило использовать гемокомпоненты без риска трансмиссии ЦМВ.
При обследовании 580 гематологических больных и 41 ребенка с соматическими заболеваниями определена клиническая потребность в ЦМВ-негативных донорах, которая составила около 5% у больных гематологической клиники ФБГУ РосНИИГТ ФМБА России и 55,9% – у детей в возрасте от 1 года до 10 лет.
Разработаны алгоритмы обеспечения ЦМВ-вирусной безопасности гемокомпонентной терапии у иммуносупрессивных реципиентов, предложены этапы обследования доноров и больных с одновременным использованием серологических и молекулярно-биологических методик, определены критерии отвода доноров. Ввиду малого числа ЦМВ-серонегативных доноров показана возможность использования гемокомпонентов серопозитивных доноров без признаков реактивации (в ИФА) и отрицательной реакции на геном ЦМВ (в ПЦР) на момент донации. Рекомендовано применение метода криоконсервирования ЦМВ-негативных гемокомпонентов для создания долгосрочных запасов.
В целом внедрение в практику алгоритмов обследования донора и реципиента на ЦМВ, основанных на результатах ИФА и ПЦР-тестирования, позволит существенно уменьшить опасность трансмиссии ЦМВ при гемотрансфузиях и создаст предпосылки для организации банка криоконсервированных ЦМВ-негативных гемокомпонентов для больных «группы риска».
Литература
1. Царапкин И.М., Волкова С.Д., Бессмельцев С.С. и др. Проблема герпесвирусной инфекции в трансфузиологии: Обзор литературы // Вестн. службы крови России. – 2011. – № 4. – С. 42–48.
2. Khaiboullina S.F., Maciejewski I.P., Crapnell K. et al. Human cytomegalovirus persists in myeloid progenitors and is passed to the myeloid progeny in a latent form // Br. J. Haematol. – 2004. – Vol. 126, № 3. – Р. 410–417.
3. Pignatelli S., Dal Monte P., Rossini G. et al. Latency-associated human cytomegalovirus glycoprotein N genotypes in monocytes from healthy blood donors // Transfusion. – 2006. – Vol. 46, № 10. – P. 1754–1762.
4. Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека. Руководство для врачей. – СПб: СпецЛит, 2013. – 190 с.
5. Федоров Н.А., Елов А.А., Суханов Ю.С. и др. Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации. – М.: Полиграфсервис, 2003. – C. 210.
6. Чеботкевич В.Н., Волкова С.Д., Бурылев В.В. и др. Герпесвирусные инфекции и проблемы инфекционной безопасности гемотрансфузий у иммуносупрессивных больных // Трансфузиология. – 2012. – Т. 13, № 1. – С. 22–41.
7. Kűhn J.E. Transfusion-associated infections with cytomegalovirus and other human herpesviruses // InfusionstherTransfusionsmed. – 2000. – Vol. 27, № 3. – Р. 138–143.
8. Волкова С.Д., Кайтанджан Е.И., Бурылев В.В. и др. Герпесвирусная инфекция в клинической практике // Трансфузиология. – 2013. – № 4. – С. 48–56.
9. Кайтанджан Е.И., Волкова С.Д., Бурылев В.В. и др. Герпесвирусные инфекции у иммуносупрессивных больных и инфекционная безопасность гемотрансфузий // Вестн. гематологии. – 2012. – T. 8, № 1. – С. 4–10.
10. Pamphilon D.H., Rider J.R., Barbara I.A. Prevention of transfusion – transmitted cytomegalovirus
infection // Transfus. Med. – 1999. – № 9. – P. 115–123.
11. Frascaroli G., Varani S., Moepps B. et al. Human cytomegalovirus subverts the functions of monocytes, impairing chemokine-mediated migration and leukocyte recruitment // J. Virol. – 2006. – Vol. 80, № 15. – P. 7578–7589.
12. Ширяев С.Н., Боровкова А.С., Смиренникова М.М. и др. ЦМВ-инфекция у детей и подростков с острыми лейкозами после аллогенной трансплантации костного мозга: факторы риска, влияние на частоту осложнений и исход аллогенной трансплантации // Вестн. гематологии. – 2012. – Т. 8, № 1. – С. 96–97.
13. Chidrawar S., Khan N., Wei W. et al. Cytomegalovirus-seropositivity has a profound influence on the magnitude of major lymphoid subsets within healthy individuals // Clinical and Experymental Immunology. – 2009. – Vol. 155. – Р. 423–432.
14. Staras S.A., Dollard S.C., Radford K.N. et al. Seroprevalence of cytomegalovirus infection in the United States, 1988–1994 // Clin. Infect. Dis. – 2006. – Vol. 43, № 9. – Р. 1152–1153.
15. Прокопенко Е.И. Вирусные инфекции и трансплантация почки (Обзор литературы) // Нефрология и диализ. – 2003. – Т. 5, № 2. – С. 6–13.
16. Ziemann M., Krueger S., Maier A. et al. High prevalence of cytomegalovirus DNA in plasma samples of blood donors in connection with seroconversion // Transfusion. – 2007. – Vol. 47, № 11. – P. 1955–1958.
17. Об утверждении правил клинического использования донорской крови и (или) ее компонентов: приказ Минздрава России от 2 апреля 2013 г. № 183н // Российская газета. - 2013 г. – 28 августа. – Федеральный выпуск № 6166.
18. Балашов Д.Н., Трахтман П.Е., Скоробогатова Е.В. и др. Факторы риска цитомегаловирусной инфекции у пациентов после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Онкогематология. – 2010. – № 4. – С. 20–26.
19. Bowden R.A., Slichter S.J., Sayers M. et al. A comparison of filtered leukocytereduced and cytomegalovirus (CMV) seronegative blood products for the prevention of transfusion-associated CMV infection after marrow transplant // Blood. – 1995. – Vol. 86. – Р. 3598–3603.
20. Mazeron M.C. Leykocyte depletion and infection by cytomegalovirus // Transfus. Clin. Biоl. – 2000. – № 7. – P. 31 35.
21. Visconti M.R., Pennington J., Garner S.F. et al. Assessment of removal of human cytomegalovirus from blood components by leukocyte depletion filters using real-time quantitative PCR // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 3. – P. 1137–1139.
22. Мельникова В.Н., Селиванов Е.А., Кирьянова Г.Ю. Лейкоредукция гемокомпонентов с помощью отечественных устройств для удаления лейкоцитов // Медицина экстремальных ситуаций. – 2012. – Т. 39, № 1. – С. 76–84.
23. Селиванов Е.А., Данилова Т.Н., Дегтерева И.Н. Служба крови России: Современное состояние и перспективы развития // Трансфузиология. – 2010. – T. 11, № 4. – С. 4–31.
24. Техническое руководство ААВВ, ЕSTM. – 2000. – С. 30–47.
25. Гудков А.Г. Технологии трансфузиологии. – М.: Сайнс-Пресс, 2012. – 250 с.26. Руководство по приготовлению, использованию и обеспечению качества компонентов крови // Рекомендация № R (95)15. Европейский комитет (частичное соглашение) по переливанию крови (CD-P-NS). – 2010. – Изд. 16. – С. 203–205.
27. Филатов Ф.П., Голосова Т.В. Общие принципы национальной концепции вирусной безопасности гемотрансфузий // Гематол. и трансфузиол. – 2001. – Т. 46, № 3. – С. 84–86.
28. Dodd R.Y., Notari E.P., Stramer S.L. Current prevalence and incidence of infectious disease markers and estimated window-period risk in the American Red Cross blood donor population // Transfusion. – 2002. – Vol. 42. – P. 975–979.
29. Косова Е.Ю. Прасолова М.А. Цитомегаловирусная инфекция. Лабораторная диагностика ЦМВИ: памятка врачу. – Новосибирск: Вектор-Бест, 2010. – 11 с.
30. Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С., Туполева Т.А. и др. Донор и реципиент в 21-м веке: необходимость расширения спектра исследуемых вирусных маркеров // Молекулярная диагностика: сб. трудов VII Всеросс. конф. – М., 2010. – С. 56.
31. Касьянов А.Д., Рыжкова Т.В. Частота выявления герпесвирусной инфекции у кадровых доноров гемокомпонентов // Трансфузиология. – 2007. – T. 8, № 1–2. – С. 22–23.
32. Elfath M., Luka J., Tahhan R. et al. Detection of CMV by polymerase chain reaction (PCR) in seropositive blood donors // Transfusion. – 1996. – Vol. 36. – P. 34.
33. Greenlee D.J., Fan H., Lawless K. et al. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC units // Transfusion. – 2002. – Vol. 42. – P. 403–408.