К.А. Ветошкин, С.В. Утемов, Ф.С. Шерстнев, М.Г. Князев, А.А Костяев
ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России», г. Киров
Трансфузиология №2, 2015
Резюме
Изучены результаты замораживания донорских тромбоцитных концентратов до низких и ультранизких температур под защитой нового комбинированного криоконсерванта. Установлено, что тромбоциты, криоконсервированные с новым хладоограждающим раствором и хранившиеся в течение 1 года при температурах –80 °С и –196 °С, после размораживания демонстрировали высокие функциональные свойства и осмотическую резистентность. Показана возможность длительного хранения тромбоцитов под защитой нового хладоограждающего раствора при указанных температурных режимах.
Ключевые слова: комбинированный криоконсервант, тромбоцитный концентрат, количественная и функциональная сохранность, низкие и ультранизкие температуры.
Введение
Проблема своевременного и полноценного обеспечения больных тромбоцитными концентратами (ТК) в условиях онкогематологической клиники является актуальной. Ежегодно в мире наблюдается рост потребления ТК на 5–7% [1, 2]. Увеличение числа трансфузий кровяных пластинок диктует необходимость создания постоянных запасов функционально полноценных клеток. Однако создание резерва донорских ТК лимитировано короткими сроками их хранения.
Криоконсервирование ТК в настоящее время является единственным способом создания запасов данной трансфузионной среды [3]. Неотъемлемой составляющей процесса замораживания клеточных суспензий является использование криоконсервантов. Нами выполнены экспериментальные исследования, которые позволили разработать оригинальный криоконсервант на основе комбинации криопротекторов гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) и диметилацетамида (ДМАЦ) для замораживания до- норских тромбоцитов [4].
С целью долгосрочного хранения клетки крови замораживают до низких (–80 °С) и ультранизких (–196 °С) температур [5]. Необходимость применения указанных температурных режимов связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются биохимические процессы, что позволяет сохранять биоматериал в течение достаточно длительного времени (несколько лет).
В настоящее время общепринятым способом замораживания и долгосрочного хранения тромбоцитных концентратов является жидкоазотное криоконсервирование [6]. Однако в связи с присущими указанному методу недостатками (технологические сложности, зависимость от бесперебойного снабжения жидким азотом, дороговизна) наблюдается тенденция к переходу на низкотемпературный режим хранения донорских ТК [7, 8]. Исходя из вышеизложенного, целью нашей работы стало сравнение результатов количественной и качественной сохранности кровяных пластинок, хранившихся в условиях низкой (–80 °С) и ультранизкой (–196 °С) температуры.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили образцы донорских ТК, заготовленных аппаратным методом. Замораживание тромбоцитов проводили под защитой комбинированного криоконсерванта, включавшего 2% ГМБТОЭМ и 1,75% ДМАЦ. Смешивание ТК с раствором криоконсерванта проводили в объемном соотношении 1:1, экспозиция составляла 15 минут. Замораживание концентратов клеток до –80 °С проводили в полимерных контейнерах по экспоненциальной программе [7]. С целью хранения тромбоцитов в условиях ультранизких температур охлаждение биоматериала осуществляли в программном замораживателе PLANER INTEGRA со скоростью 3 °С в мин до –90 °С [6] с последующим переносом образцов в биохранилище. Срок наблюдения составил 1 год. Размораживание производили в водяной бане при +37…+38 °С.
Количество тромбоцитов подсчитывали в камере Горяева в двух параллельных пробах [9]. Показатель кислотности (рН) концентратов тромбоцитов определяли при помощи иономера «Эксперт-001», осмолярность криоскопа ОМТ-5. Функциональную активность тромбоцитов исследовали непосредственно после получения ТК и сразу же после размораживания образцов. Оценивали адгезию тромбоцитов к стеклу [10], агрегацию, индуцированную АДФ (концентрация индуктора 2,5 мкг/мл) и адреналином (2,5 мкг/мл) с помощью лазерного агрегометра «Биола» (модель LA-230).Запись агрегатограмм осуществляли в течение 10 минут после внесения индуктора [11, 12]. Учитывали максимальную степень агрегации и средний радиус агрегатов. Реакцию на гипотонический шок (РГШ) определяли по методике [13] с использованием спектрофотометра СФ-46 при длине волны 610 нм. Оценку оптической плотности пробы проводили в течение 10 минут.Регистрировали величину возврата к исходному значению (в %). Пробы для измерения адгезии, агрегации и РГШ содержали 250 000–350 000 кровяных пластинок в 1 мкл. Сравнение полученных результатов проводили с пока- зателями нативных ТК. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью критерия Стьюдента [14].
Результаты и обсуждение
Функциональные свойства тромбоцитов после размораживания в значительной мере зависят от физико химических характеристик среды, наиболее важными из которых являются рН (показатель кислотности) и осмолярность. Так, на агрегационно-адгезионные параметры кровяных пластинок влияет показатель кислотности ТК, в то время как способность клеток к РГШ зависит от осмолярности клеточных суспензий [15]. В этой связи первоначально нами были изучены физико-химические свойства донорских ТК после 1 года хранения в условиях низких и ультранизких температур (табл. 1).
Известно, что при рН среды ниже 6,5 функциональная активность кровяных пластинок подавляется [15]. Как видно из представленных в табл. 1 данных, показатель кислотности клеточной суспензии оставался выше критического значения 6,5 при криоконсервировании ТК как при низкой температуре (–80 °С), так и в условиях жидкого азота (–196 °С). При этом не выявлено статистически достоверного различия в значении рН ТК, хранившихся при указанных режимах температур (p > 0,05).
Изучение осмотического давления концентратов кровяных пластинок показало, что ТК после размораживания характеризовались изоосмолярностью. Не выявлено статистически значимого отличия осмолярности ТК, замороженных до низких и ультранизких температур (p > 0,05). Таким образом, изученные физико-химические показатели суспензии клеток (рН и осмолярность) после размораживания не зависели от температурного режима хранения ТК.
Следующим этапом исследования стало изучение функциональных свойств донорских тромбоцитов после 1 года хранения при низкой (–80 °С) и ультранизкой (–196 °С) температурах. Результаты представлены в табл. 2.
Изменения показателей ТК после 1 года хранения проявились снижением количества тромбоцитов (до 90,3 ± 4,2% от исходного), их адгезии (до 63,5 ± 6,1% от уровня нативных клеток), способности к РГШ (до 88,8 ± 3,1%), агрегации в ответ на АДФ (65,9 ± 15,1%) и адреналин (75,3 ± 16,6%). Полученные результаты количественной и качественной сохранности ТК свидетельствуют о том, что донорские тромбоциты возможно сохранить в функционально полноценном состоянии при температуре –80 °С в течение 1 года под защитой нового криоконсерванта.
Анализ результатов хранения ТК с комбинированным хладоограждающим раствором в условиях жидкого азота показал высокую количественную сохранность клеток (88,1 ± 5,6%). В то же время отмечено незначительное снижение показателей агрегационной активности кровяных пластинок (в ответ на внесение АДФ – с 10,7 ± 2,9% до 8,0 ± 1,5%, на адреналин – от 15,7 ± 5,4% до 12,8 ± 4,3%), адгезии к стеклу (до 67,1 ± 4,0% от уровня, определенного для нативных клеток). Выявлено уменьшение среднего размера агрегатов с 4,5 ± 1,3 до 2,5 ± 0,4 (в случае индукции АДФ) и с 4,3 ± 1,3 до 2,6 ± 0,6 условных единиц (при индукции адреналином). Сохранность способности ТК к РГШ составила 85,7 ± 1,6% от значений, зарегистрированных до замораживания. Можно заключить, что, несмотря на некоторое снижение функциональных характеристик тромбоцитов, их активность осталась на приемлемом уровне (62,9–85,7% от значений нативных ТК).
Тромбоциты, криоконсервированные с новым хладоограждающим раствором и хранившиеся в течение 1 года при температурах –80 °С и –196 °С, после размораживания демонстрировали достаточные функциональные свойства и осмотическую резистентность. Сравнение показателей ТК, хранившихся при низких (–80 °С) и ультранизких (–196 °С) температурах в течение 1 года, приведено на рисунке.
Сопоставление изученных характеристик кровяных пластинок, замороженных до указанных температур, не выявило достоверных различий в количестве, агрегационно-адгезионной активности клеток и их способности к РГШ после декриоконсервирования (p > 0,05).
Выводы
1. Физико-химические показатели ТК (рН и осмолярность) после размораживания не зависели от температурного режима хранения клеток.
2. Показана возможность хранения донорских тромбоцитов в функционально полноценном состоянии при их замораживании как до низких (–80 °С), так и до ультранизких (–196 °С) температур.
3. Количественная сохранность тромбоцитных концентратов, замороженных с новым криоконсервантом и хранившихся в течение 1 года при температуре –80 °С, после размораживания составила более 90%, их функции – от 63,5 до 88,8%, а при –196 °С – более 88% количества тромбоцитов с функ- циональной активностью от 62,9 до 82,7% (по данным различных тестов).
Литература
1. Slichter S. New thoughts on the correct dosing of prophylactic platelet transfusions to prevent bleeding // Curr. Opin. Hematol. – 2011. – Vol. 18, № 6. – P. 427–435.
2. Slichter S.J. Platelet transfusion: future directions // Vox Sang. – 2004. – Vol. 8, № 2. – P. 47–51.
3. Чечеткин А.В., Багаутдинов Ш.М., Копелец А.В. Становление, современное состояние и перспективы развития криоконсервирования клеток крови в России // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. – 2005. – № 2. – С. 38–41.
4. Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток – Сыктывкар: Информационно- издательский отдел Коми НЦ УрО РАН, 2010. – 80 с.
5. Fuller B., Lane N., Benson E. Life in the frozen State. – London, New York, Washington: CRS
Press, 2004. – 672 р.
6. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. – М., 1995. – 21 с.
7. Кузнецов К.В. Консервирование тромбоцитов замораживанием при –80 °С по экспоненциальной программе (экспериментальное исследование): автореф. дис. ... канд. мед. наук. – СПб., 2006. – 23 с.
8. Шерстнев Ф.С. Эффективность трансфузий криоконсервированных при –80 °С донорских тромбоцитных концентратов у больных гемобластозами: автореф. дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2013. – 23 с.
9. Перфильева Е.А., Плеская Л.Г., Фокина Т.В., Калинин Н.Н. Совершенствование под- счета клеток в компонентах крови / // Гематология и трансфузиология. – 2003. – Т. 48, № 2. – С. 44–46.
10. Marx R., Derlath S. Never eine Method zur verggleihend quantitativen Bestimmung der thrombocyten adhasivitat an blutfremden overflachen // Blut. – 1957. – № 3. – Р. 247–254.
11. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. Новый высокочувствительный метод анали- за агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело. – 1989. – № 10. – С. 15–18.
12. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. – М.:
Тверь: Триада, 2005. – 227 с.
13. Handin R.I., Fortier N.L., Valeri C.R. Platelet respons to hypotonic stress after storage // Transfusion. – 1970. – Vol. 10, № 6. – P. 305–309.
14. Гланц С. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999. – 459 с.
15. Цуцаева А.А. Криоконсервирование клеточных суспензий. – Киев: Наукова думка, 1983. – 240 с.